Исследования

В рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» с 2014 по 2016 год реализуется масштабный зонтичный проект по метагеномному исследованию кишечной микрофлоры в связи с различными заболеваниями.  В рамках Соглашения о предоставлении субсидии  № 14.575.21.0076 от 22.08.2014г. с Минобрнауки России  на базе КФУ проводится исследование 250 пациентов с заболеваниями, ассоциированными с Helicobacter pylori. 

В ходе выполнения проекта "Создание диагностической панели для оценки качественного и количественного состава микробиоты содержимого кишечника" по Соглашению о предоставлении субсидии  №14.575.21.0076 от 22.08.2014 на этапе № 1 в период с 22.08.2014 по 21.12.2014 выполнялись следующие работы:

1.1 Работы, выполненные за счет средств субсидии

По п.1.1. ПГ Аналитический обзор информационных источников

По п.1.2. ПГ Проведение патентных исследований по ГОСТ Р 15.011-96

По п. 1.3. ПГ Исследование, обоснование и выбор методов и средств, направления исследований и способы решения поставленных задач, в том числе проведение сравнительной оценки эффективности возможных направлений исследований, в том числе с учетом результатов прогнозных исследований

По п. 1.4.ПГ  Создание критериев включения и исключения пациентов из исследования

По п. 1.5. ПГ Разработка системы контроля качества образцов микробиоты кишечника человека

По п. 1.6. ПГ Разработка методики подготовки и хранения биологических образцов

По п. 1.7. ПГ Создание банка образцов микробиоты кишечника пациентов с H. pylori-ассоциированными заболеваниями до и после проведения эрадикационной терапии и получение не менее 50 образцов (30 образцов с патологией и 20 контрольных образцов у лиц, не имеющих H. pylori)

По п. 1.8. ПГ Полногеномное секвенирование не менее 50 образцов микробиоты кишечника

По п. 1.9. ПГ Определение генов антибиотикорезистентности на фоне эрадикационной терапии, генетических маркеров микробиоты, характерных для пациентов, инфицированных H. pylori

По п. 1.10. ПГ Разработка не менее 2-х вариантов экспериментальных образцов диагностической панели

1.2 Работы, выполненные за счет внебюджетных средств

По п.2.1 ПГ Разработка программы и методик исследовательских испытаний экспериментальных образцов диагностической панели

По п. 2.2 ПГ Материально техническое обеспечение экспериментальных работ этапа

2 Основные результаты, полученные в отчётный период

По п. 1.1. ПГ подготовлена обзорная статья, посвященная влиянию H.pylori и эрадикационной терапии на состав микробиоты кишечника, их роли в формировании устойчивости представителей микробиоты кишечника к антибактериальным препаратам.

Обзор информационных источников указывает но то, что инфицирование H.pylori, а также эрадикационная терапия могут привести к изменениям состава микробиоты кишечника, которые характеризуются снижением разнообразия микроорганизмов; уменьшением числа облигатных анаэробов, преобладающих в норме; увеличением числа факультативных аэробных микроорганизмов.

Долгосрочным последствием антибактериальной терапии является развитие устойчивых к антибактериальным препаратам штаммов бактерий. Резистентность может быть обусловлена наличием генов резистентности, которые бактерии приобрели в результате мутаций или горизонтального переноса. Эти гены могут распространяться не только среди патогенных бактерий, в связи с наличием которых проводится антибактериальная терапия, но и среди представителей нормальной микрофлоры, которая впоследствии может модифицироваться и утрачивать свои полезные свойства.

Таким образом, микрофлора кишечника может служить потенциальным резервуаром генов резистентности и способствовать развитию устойчивости к антибиотикам других представителей микробиоты человека.

По п. 1.2. ПГ проведены патентные исследования по ГОСТ Р 15.011-96, подготовлен отчет о патентных исследованиях, свидетельствующий о новизне и патентноспособности выбранного направления исследований.

По п. 1.3. ПГ проведенный сравнительный анализ методов исследования кишечной микрофлоры указывает на неоспоримые преимущества методов полногеномного секвенирования для анализа качественного и количественного разнообразия микробиоты. С учетом неинвазивности и отсутствия ущерба для пациента обоснован выбор кала в качестве объекта исследования. Промежуточный отчет о ПНИ готов на 70%.

По п. 1.4. ПГ созданы критерии включения и исключения пациентов из исследования на основе наличия/отсутствия показаний к эрадикационной терапии, наличия письменного согласия на исследование, а также отсутствия ряда сопутствующих заболеваний.

По п. 1.5. ПГ разработана система контроля качества образцов микробиоты кишечника человека на основе первичных признаков качества самого образца кала и количества и чистоты ДНК, выделяемой из этого образца.

По п. 1.6. ПГ разработана методика подготовки и хранения биологических образцов. Методика основана на использовании коммерческого набора реагентов для выделения ДНК из кала, а также включает пошаговую инструкцию по подготовку геномных библиотек и протокол секвенирования на платформе высокопроизводительного секвенатора Solid 5500w.

По п. 1.7. ПГ Создан банк образцов микробиоты кишечника пациентов с H. pylori-ассоциированными заболеваниями до и после проведения эрадикационной терапии и получение не менее 50 образцов (30 образцов с патологией и 20 контрольных образцов у лиц, не имеющих H. pylori), подготовлен Акт о создании банка образцов.

По п. 1.8. ПГ Произведено полногеномное секвенирование 50 образцов микробиоты кишечника, подготовлен Акт о полногеномном секвенировании.

По п. 1.9. ПГ Определены гены антибиотикорезистентности на фоне эрадикационной терапии, включая точечные мутации в гене 23s рРНК H.pylori. Охарактеризовано порядка 200 генетических маркеров микробиоты, характерных для пациентов, инфицированных H. pylori.

По п. 1.10. ПГ Разработано два варианта экспериментальных образцов диагностической панели, включающие различное сочетание праймеров для оценки таксономического состава и функционального состояния микробиоты человека.

По п. 2.1. ПГ За счет внебюджетных средств разработана программа и методики  исследовательских испытаний экспериментальных образцов диагностической панели.

По п. 2.2. ПГ За счет собственных средств индустриального партнера были разработаны и синтезированы праймеры под  намеченные генетические маркеры патологических состояний у пациентов, инфицированных H. pylori  и проходящих эрадикационную терапию, необходимые для создания экспериментальных образцов диагностической панели. 

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

В ходе выполнения работ в соответствии с планом-графиком на этапе № 2 и 3 в период с 01.01.2015 по 31.12.2015 были получены следующие результаты:

Собрана коллекция из более чем 150 образцов микробиоты до и после лечения инфекции H. pylori, а также от лиц контрольной группы, проведено их полногеномное секвенирование и первичный биоинформационный анализ.

За счет внебюджетных средств проведен анализ рынка комплектующих и сырья для создаия диагностичекой панели, который выявил порядка десяти отечественных и зарубежных поставщиков.

Проведены маркетинговые исследования в связи с проблемой инфекции H. pylori и рынка медико-диагностических услуг. Обнаружена высокая потребность данной отрасли в разрабатываемой диагностической панели. 

По результатам НИР в 2015 году опубликовано две научные статьи и подано две заявки на охранный документ РИД:

1. Н.Л. Бруслик, Д.Р. Ахатова, А.А. Тойменцева, С.Р. Абдулхаков, О.Н. Ильинская, Д.Р. Яруллина  Оценка лекарственной устойчивости пробиотических лактобацилл // Антибиотики и химиотерапия, 2015. - 60. - С. 3-4.

2. Д.Д. Сафина, С.Р. Абдулхаков, Т.В. Григорьева, М.И. Маркелова, Р.К. Исмагилова, Д.Р. Хуснутдинова, С.Ю. Маланин, А.В. Лайков, М.Н. Синягина, Р.А. Абдулхаков, В.М. Чернов  Влияние фармакотерапии на генетическое разнообразие биоценоза кишечника // Гены и клетки, 2015. - Т. 10, №4. - С. 1-6.

3. Заявка на патент РФ № 2015155432 от 24.12.2015 Способ диагностики состояния микробиоты кишечника на фоне эрадикационной терапии Helicobacter pylori и его применение.

4. Заявка на БД  № 2015621634 от 21.12.2015 База данных генетических маркеров антибиотикорезистентности кишечной микрофлоры при эрадикационной терапии Helicobacter pylori для создания диагностической панели.