Проточная цитофлуометрия: революция в диагностике

6-7 апреля в КФУ побывал гость из Северной столицы - старший научный сотрудник отдела иммунологии кафедры цитологии и гистологии Санкт-Петербургского государственного университета и НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, специалист в области проточной цитофлуриметрии Игорь Кудрявцев.

Он щедро поделился своими знаниями, прочитав 2 интересные и содержательные лекции для студентов, аспирантов и сотрудников ИФМиБ КФУ, желающих расширить свои знания о методе проточной цитофлуориметрии. Это одновременное многопараметровое исследование таких объектов, как клетки, хромосомы, клеточные органеллы, бактерии, дрожжи, планктон и др. Они предварительно метятся моноклональными антителами, конъюгированными с флуоресцентными молекулами или красителями, специфически связывающимися с определенными компонентами клеток.

В 1-й лекции ?Проточная цитометрия - принципы и основные возможности? он рассказал об истории становлении этого метода и пути его развития.  В основе проточной цитометрии лежит проведение оптических и флуоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч. Слушатели узнали, что количество параметров которые можно было одновременно детектировать для одной клетки, постепенно увеличивалось с открытием новых флуоресцентных молекул и создания тандемных красителей.

Рассказал И.Кудрявцев и о современных проточных цитофлуориметрах - совершенных приборах с 5 лазерами, излучающими световые волны разной длины: ультрафиолетовый (длина волны - 355 нм), фиолетовый (407 нм), голубой (488 нм), желтый (561 нм) и красный (637 нм). Такой прибор может одновременно оценить 18 параметров для одной клетки, так как число красителей с разными спектрами поглощения и эмиссии, которые могут быть одновременно им детектированы составляет 18.

По словам гостя, из-за широкого спектра исследуемых объектов и возможности одновременной оценки большого количества параметров, проточная цитометрия  становится незаменимым инструментом для анализа:

- поверхностных и внутриклеточных молекул в норме и в ответ на стимуляцию;

- основ функционирования отдельных органелл и процессов в них происходящих;

- функциональной активности клеток (пролиферация, апоптоз, фаго- и пиноцитоз, продукция активных форм кислорода и азота);

- поиск и подсчет ?редких? клеточных популяций в различных образцах.

Поэтому проточные цитофлуориметры должны стать не только важнейшими исследовательскими инструментами, но и основными инструментами медицинских учреждений - для идентификации и количественной оценки популяций клеток в периферической крови или костном мозге.

2-я лекция была посвящена методам оценки пролиферации и гибели клеток в условиях in vitro. И.Кудрявцев обратил внимание аудитории на основные современные методы и красители, используемые для оценки распределения клеток по стадиям клеточного цикла, динамики пролиферации и уровня апоптоза в клетках млекопитающих. Только для окрашивания дезоксирибонуклеиновых кислот  при исследовании клеточного цикла существует более 20 красителей (7-AAD, пропидиум йодид и  др.). А способы оценки уровня апоптоза в клетках основываются на явлениях изменения мембранного потенциала митохондрий, активации каспаз, активации белков-регуляторов апоптоза, появления на внешнем слое плазматической мембраны фосфатидилсерина и на разрывах в ДНК.

На каждый из вышеперечисленных признаков апоптоза сейчас разработаны широкие палитры красителей, которые можно комбинировать. В медицинской практике особенно востребовано определение пролиферативной активности лимфоцитов в крови пациента, для выявления иммунодефицитов, инфекционных процессов, а также для мониторинга состояния после пересадки органов и тканей. 

Отметим, что метод проточной цитофлуориметрии широко используется в НОЦ фармацевтики и в возглавляемой Альбертом Ризвановым OpenLab генных и клеточных технологий КФУ. Там есть 1 проточный цитофлуориметр ?Guava 8HT, Millipore? и клеточный сортер ?FACS Aria III, BD? на основе проточного цитофлуориметра. Этот прибор ? новый этап развития метода проточной цитофлуориметрии: с его помощью возможно не только оценивать параметры клеток, но и разделять смешанную популяцию клеток на субпопуляции для дальнейшей аналитической работы.