Наши проекты при поддержке Минобрнауки России 2014-2016
Значительную часть работы лаборатории занимают междунaродные проекты. Так, в 2014 году были инициированы совместные с Институтом Агробиологических наук (г. Цукуба, Япония) исследования в области разработки новых методов хранения биологического материала в обезвоженном состоянии без потери жизнеспособности.
В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27 августа 2014 года № 14.584.21.0002 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 1 в период с 28 августа 2014 года по 31 декабря 2014 выполнялись следующие работы: Проведены патентные исследования в области криохранения и безводного хранения белков и клеток в соответствии ГОСТ Р 15.011-96. Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках прикладных научных исследований. Осуществлен выбор и обоснование направления исследований. Проведен анализ геномных данных секвенирования ангидробиотической хирономиды.
Среди основных результатов следует отметить следующие: реализуемый совместно с японским партнером проект является первым комплексным исследованием, использующим сильные стороны полностью ангидробиотических клеток животных, и выбор экспериментальной стратегии использование естественных генетических регуляторных элементов чувствительных к обезвоживанию является одной из оптимальных стратегий. Анализ генома единственного ангидробиотического насекомого позволил уже на данном успешно выделить, по меньшей мере, 27 участков, несущих двунаправленные регуляторные элементы, которые на следующем этапе будут использованы для создания генетических конструкций экспрессия белков, в которых инициируется обезвоживанием. Иностранным партнером проведен анализ пригодности клеток Pv11 к методам экзогенной экспрессии чужеродных белков и выделена наиболее перспективная стратегия создание генетических конструкций для экспериментальной части работ на втором этапе проекта. Скоординированная и взаимодополняющая работа японской и российской исследовательской групп (выраженная, в том числе и в проведении рабочей встречи на территории Казанского Федерального Университета в октября 2014 года) показала свою эффективность. На следующем этапе, полученные партнерами результаты были использованы для практический части проекта.
На втором этапе реализации проекта с 1 января 2015 года по 30 июня 2015 года были осуществлены следующие работы: проанализированы транскриптомные данные хирономиды, секвенирован геном и транскриптом клеток Pv11. Работа иностранного партнера состояла в выделении наиболее перспективные участки генома несущие активно экспрессирующиеся промоторы.
Основные результаты этапа. На данном этапе проводились экспериментальные работы по анализу дифференциальной экспрессии генов в личинках хирономиды P.vanderplanki на разных стадиях обезвоживания и регидратации. Этот подход позволил выявить ключевые гены, активность которых обеспечивает устойчивость организма личинки к полной потере воды.
Функционально, эти гены можно подразделить на несколько групп. Во-первых, это гены, обеспечивающие замену воды в клетках на не восстанавливающий сахар трегалозу. К ним относятся, прежде всего, трегалозо — синтаза и редуктаза, необходимые для синтеза дисахарида; транспортеры трегалозы, обеспечивающие доставку сахара из мест его биосинтеза. Кроме того, важной частью является функционирование аквапоринов, обеспечивающих перенос молекул воды из клеток во внешнее пространство. Во-вторых, это гены, продукты которых обеспечивают интактность, или консервирующие другие чувствительные к обезвоживанию биомолекулы. В эту группу генов можно отнести гены белков теплового шока, причем, как малых Hsp, так и кодирующих белки с высокой молекулярной массой (70 и 90). Чрезвычайно интересной группой генов, обнаруженной в геноме хирономиды и экспрессирующейся на высоком уровне во время обезвоживания, являются гены Lea-белков. Эти белки не имеют третичной структуры в растворе, но приобретают ее в условиях обезвоживания. По-видимому, они связываются с другими белками, обеспечивая их сохранность в стрессовых условиях. К третьей группе генов ответа на ангидробиоз являются защитные белки и, прежде всего, к ним относятся антиокиданты. Гены разных групп антиоксидантов не только мультиплицировались в геноме P. vanderplanki, но и приобрели ярко выраженную модель экспрессии в ответ на стресс обезвоживания.
Очень интересным фактом является то, что множество генов являются специфичными для вида P. vanderplanki и их ортологи не найдены у других видов животных, в том числе насекомых. Предполагается, что такое множество генов, выполняющих сходную функцию являются тканеспецифичными т.е. их активность связана с определенным видом клеток. Альтернативной гипотезой, является, что устойчивость к обезвоживанию обуславливается высокой концентрацией антиоксидатнов, защитных белков и других необходимых молекул, что и обеспечивается высокой копийностью генов. Для уточнения этого вопроса был проведен анализ генома и транскриптома культуры клеток эмбриональной линии хирономиды. Показано, что геномы культуры клеток и личинок отличаются не более чем на 1-2 % и секвенирование генома клеточной культуры позволило значительно улучшить сборку. Анализ экспрессионной активности генов клеточной культуры на разных стадиях обезвоживания позволил выявить минимальных набор генов, необходимых для сохранения жизнеспособности при сильных стрессовых условиях. Это значительно упростит выбор генов для гиперэкспрессии в других клетках при создании технологий безводного хранения биоматериала. Одним из самых важных достижение этапа явилось установление того факта, что сигнальной молекулой, запускающей инициацию транскрипции генов стрессового ответа, является трегалоза, а не сигнал потери воды. Также выделены наиболее перспективные для генетических манипуляций участки генома, несущих двунаправленные регуляторные элементы.
Стоит отметить, что результаты работы на данном этапе полностью согласуются с изначальной стратегией проекта и отвечают требованиям технического задания.
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетных этапах исполненными надлежащим образом.
На третьем этапе проводились экспериментальные работы по созданию генетических конструкций, несущих гены флуоресцентных белков под контролем двунаправленных регуляторных элементов из генома хирономиды P.vanderplanki. Основными результатами третьего этапа работ являются следующие:
- Осуществлён компьютерный дизайн оптимальных конструкций для синтеза рекомбинантных белков.
- Созданы генетические конструкции pDDREII-GFP-CFP и pEFII-GFP-CFP, несущие двунаправленные cis-элементы, активирующиеся в ответ на обезвоживание, контролирующие 2 флуоресцентных белка и промотор гена GAPDH, обеспечивающий конститутивную экспрессию третьего белка.
- Иностранным партнёром осуществлена трансфекция генетических конструкций в клетки Pv11 и проведена оценка эффективности экспрессии репортерных генов, инициируемой в ответ на стресс. Данная часть работ выполнена иностранным партнером. Экспрессия репортерных генов была осуществлена в клетках Pv11 под действием обезвоживания.
- В результате оценки эффективности экспрессии генов, отмечена относительно слабая постоянная экспрессия генов под контролем cis-элемента GAPDH и высокая индуцируемая высыханием экспрессия генов, находящихся под контролем двунаправленных cis-элементов DDRE II и EF II.
- Выявлен cis-элемент P121, способный обеспечить более высокий уровень постоянной экспрессии генов, по сравнению с испытанными cis-элементами, активирующимися в ответ на обезвоживание.
- Подана заявка на патент «Генетическая конструкция для экспрессии генов в клетках насекомого Polypedilum vanderplanki». В соответствии с требованиями Технического задания о регистрации полученных результатов интеллектуальной деятельности, способных к правовой охране, заявка на патент зарегистрирована в федеральном государственном научном учреждении «Центр информационных технологий и систем органов исполнительной власти» (ЦИТиС), регистрационный номер РИД 615123050005, дата регистрации РИД 30.12.2015.
На четвертом этапе работ проводились экспериментальные работы по созданию генетических конструкций и их доставки в ооциты млекопитающих. Основные результаты четвёртого этапа работ:
- Создана (экспериментально получена) генетическая конструкция pDDREII-GFP-Eluc, несущая ген Eluc, кодирующий чувствительный к обезвоживанию белок (люцифераза). Ввиду наличия cis-элемента DDREII, активирующегося в ответ на обезвоживания, использование данной генетической конструкции позволяет осуществить контролируемый медленным обезвоживанием синтез рекомбинантных белков в клетках Pv11, устойчивых к полному обезвоживанию.
- Создана (экспериментально получена) генетическая конструкция pPG121-Eluc, несущая ген Eluc, кодирующий чувствительный к обезвоживанию белок (люцифераза). Наличие промотора P121 в данной конструкции обеспечивает высокий уровень экспрессии целевого белка.
- Осуществлена трансфекция генетических конструкций pPG121-Eluc и pDDREII-GFP-Eluc в клетки Pv11 методом электропорации. Осуществлён контролируемый медленным обезвоживанием синтез рекомбинантных белков в клетках Pv11, устойчивых к полному обезвоживанию. Разработан соответствующий протокол. Подтверждено сохранение активности чувствительного к обезвоживания белка (люциферазы) при его обезвоживании в клетках Pv11.
- Проведена серия экспериментов по выявлению конкретного сигнала, стимулирующего экспрессию полученных конструкций в ответ на обезвоживание. Стимуляция клеток Pv11 была проведена тепловым шоком. маннитолом, трегалозой, раствором NaCl, и легким окислительным стрессом. Выявлена стимуляция экспрессии полученных конструкций в ответ на добавление трегалозы и осмотический стресс, смоделированный путём добавления NaCl.
- Иностранным партнёром созданы генетические конструкции, несущие регуляторные элементы чувствительные к обезвоживанию, для экспрессии целевых белков в ооцитах млекопитающих. Выполнена отработка методов доставки плазмид.
Таким образом, поставленные цели и задачи четвёртого этапа работ в соответствии с требованиями технического задания и календарного плана были выполнены в полном объеме.
Иностранным партнером в исследовании выступает группа исследований ангидробиоза Национального института агробиологических наук (Цукуба, Япония). В исследовании принимали участие следующие специалисты:
-доктор Такахиро Кикавада – руководитель работ, ведущий научный сотрудник Национального института агробиологических наук;
-доктор Ришар Корнетт – ведущий научный сотрудник Национального института агробиологических наук;
-доктор Джун Окада – постдок Национального института агробиологических наук;
-доктор Йоичиро Согаме — постдок Национального института агробиологических наук;
-Юки Сато – лаборант Национального института агробиологических наук.
Иностранным партнером была осуществлена трансфекция созданных генетических конструкций в клетки Pv11 и проведена оценка эффективности экспрессии репортерных генов, инициируемой в ответ на стресс. Этот этап является необходимым для оценки возможности создания всех остальных генетических конструкций медицинского и сельскохозяйственного назначения.
