Получение клеточной линии рака поджелудочной железы, стабильно экспрессирующей доксициклин-зависимую эндонуклеазу Cas9

А.К. Нургалиева, В.С. Скрипова, Л.Ф. Минигулова, Р.Г. Киямова

Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия

Полный текст PDF

Аннотация

Рак поджелудочной железы (РПЖ) является одним из наиболее тяжелых и агрессивных онкологических заболеваний. РПЖ характеризуется невысокой выживаемостью и отсутствием методов ранней диагностики. На сегодняшний день химиотерапия и другие методы лечения РПЖ являются малоэффективными из-за высокой степени резистентности опухолей. Для повышения эффективности терапии РПЖ важно понимание механизмов, отвечающих за развитие устойчивости опухолевых клеток к применяемым препаратам, и выявление новых генов, ответственных за чувствительность к противоопухолевой терапии. Одним из инструментов, позволяющих идентифицировать гены, продукты которых могут регулировать чувствительность к химиотерапевтическим препаратам, является технология CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), которая подразумевает использование эндонуклеазы Cas9 для внесения двухцепочечных разрывов в последовательность изучаемых генов.

Целью работы является получение клеточной линии рака поджелудочной железы MIA PaCa-2, экспрессирующей доксициклин-зависимую эндонуклеазу Cas9. Для этого с помощью упаковочных плазмид и плазмиды, содержащей ген эндонуклеазы Cas9, были получены лентивирусные частицы, содержащие ген эндонуклеазы Сas9. Полученными лентивирусными частицами была проведена трансдукция клеточной линии рака поджелудочной железы MIA PaCa-2 для получения моноклонов, стабильно экспрессирующих эндонуклеазу Сas9. Для проверки наличия экспрессии эндонуклеазы Cas9 в моноклональных клеточных линиях MIA-PaCa-2/Cas9 применяли вестерн-блот-анализ антителами против FLAG эпитопа.

В результате проведенной работы были получены две моноклональные клеточные линии РПЖ, стабильно экспрессирующие эндонуклеазу Сas9 (MIA PaCa-2/Cas9-D8 и MIA PaCa-2/Cas9-G10), которые могут быть использованы для поиска генов, вовлеченных в регуляцию чувствительности к химиотерапевтическим препаратам.

Ключевые слова: рак поджелудочной железы, CRISPR/Cas9, эндонуклеаза Cas9, MIA PaCa-2

Литература

1. Baines A.T., Martin P.M., Rorie C.J. Current and emerging targeting strategies for treatment of pancreatic cancer // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. – 2016. – V. 144. – P. 277–320. – doi: 10.1016/bs.pmbts.2016.09.006.
2. Liu H., Li L., Chen H., Kong R., Pan S., Hu J., Wang Y., Li Y., Sun B. Silencing IGFBP-2 decreases pancreatic cancer metastasis and enhances chemotherapeutic sensitivity // Oncotarget. – 2017. – V. 8, No 37. – P. 61674–61686. – doi: 10.18632/oncotarget.18669.
3. Li J., Wientjes M.G., Au J.L. Pancreatic cancer: Pathobiology, treatment options, and drug delivery // AAPS J. – 2010. – V. 12, No 2. – P. 223–232. – doi: 10.1208/s12248-010-9181-5.
4. Смирнов А.В., Юнусова А.М., Лукьянчикова В.А., Баттулин Н.Р. Система CRISPR/Cas9 – универсальный инструмент геномной инженерии // Вавил. журн. генетики и селекции. – 2016. – Т. 20, № 4. – С. 493–510. – doi: 10.18699/VJ16.175.
5. Bi H., Yang B. Gene editing with TALEN and CRISPR/Cas in rice // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. – 2017. – V. 149. – P. 81–98. – doi: 10.1016/bs.pmbts.2017.04.006.
6. Гробер Н.А., Сухан Т.О., Кузнецова Е.И. CRISPR/CAS9 – Система редактирования генома с использованием технологии нуклеофекции // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы IX Междунар. конгресса. – 2017. – Т. 1. – С. 265–266.
7. Skripova V., Serebriiskii I., Abramova Z., Astsaturov I., Kiyamova R. CRISPR/Cas9 technique for identification of genes regulating oxaliplatin resistance of pancreatic cancer cell line // BioNanoScience. – 2016. – V. 7, No 1. – P. 97–100. – doi: 10.1007/s12668-016-0272-3.
8. Gaponova A.V., Deneka A.Y., Beck T.N., Liu H., Andrianov G., Nikonova A.S., Golemis E.A., Serebriiskii I.G. Identification of evolutionarily conserved DNA damage response genes that al­ter sensitivity to cisplatin // Oncotarget – 2017. – V. 8, No 12. – P. 19156–19171. – doi: 10.18632/oncotarget.13353.
9. Wang T., Wei J.J., Sabatini D.M., Lander E.S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system // Science. – 2014. – V. 343. – P. 80–84. – doi: 10.1126/science.1246981.
10. Ryan J.A. Cell Cloning by Serial Dilution 96 Well Plates: Protocol // Life Sciences. – 2008. – URL: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/protocols/Single_cell_ cloning_protocol.pdf.

Поступила в редакцию

29.11.17

Нургалиева Алсина Камиловна, студент кафедры биохимии и биотехнологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: alsina97@mail.ru

Скрипова Вера Сергеевна, аспирант кафедры биохимии и биотехнологии, младший научный сотрудник НОЦ «Биомедицинские технологии»

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: vsk190@gmail.com

Минигулова Лейсан Фаритовна, аспирант кафедры биохимии и биотехнологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: minigulovalf@gmail.com

Киямова Рамзия Галлямовна, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и биотехнологии, старший научный сотрудник НОЦ «Биомедицинские технологии»

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: kiyamova@mail.ru

Для цитирования: Нургалиева А.К., Скрипова В.С., Минигулова Л.Ф., Киямова Р.Г. Получение клеточной линии рака поджелудочной железы, стабильно экспрессирующей доксициклин-зависимую эндонуклеазу Cas9 // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. – 2018. – Т. 160, кн. 3. – С. 386–394.

For citation: Nurgalieva A.K., Skripova V.S., Minigulova L.F., Kiyamova R.G. Obtaining a pancreatic cancer cell line stably expressing doxycycline-dependent endonuclease Cas9. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2018, vol. 160, no. 3, pp. 386–394. (In Russian)

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.