Кристаллическая структура биназы не отражает ее нативную конформацию

Е.В. Дудкина¹, В.В. Ульянова¹, Ю.В. Сурченко¹, Н.Т. Нгуен², А.И. Колпаков¹, О.Н. Ильинская¹

¹ Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия

² Ханойский медицинский университет, г. Ханой, 116001, Вьетнам

Полный текст PDF

Аннотация

Биназа, секретируемая рибонуклеаза (РНКаза) Bacillus pumilus, известна как перспективный агент альтернативной химиотерапии рака, обладающий апоптоз-индуци­рующим действием по отношению к клеткам, экспрессирующим онкогены ras, kit, AML-ETO. Кристаллическая структура мутанта биназы с двумя точечными заменами Glu43Ala/Phe81Ala свидетельствует об отсутствии димерных форм белка, характерных для биназы дикого типа. В настоящей работе с целью характеристики нативной структурной организации проведен электрофоретический и хроматографический анализ мутанта Glu43Ala/Phe81Ala. Показано, что мутантный фермент, как и биназа дикого типа, обладает каталитически активными димерами разного уровня стабильности, идентифицированными не только в денатурирующих, но и в нативных условиях. Установлено, что в биназе в преобладающем количестве представлена стабильная димерная форма, тогда как мутант Glu43Ala/Phe81Ala в большей степени представлен нестабильными димерами. Хотя каталитическая активность мутанта по отношению к природному субстрату – РНК – по сравнению с ферментом дикого типа была ниже, он проявил на 32–35% более высокую цитотоксичность в отношении клеток аденокарциномы легких человека. Полученные данные свидетельствуют о вкладе структурной организации РНКаз в их цитотоксичность и подтверждают значимость анализа нативной конформации цитотоксичных белков.

Ключевые слова: рибонуклеаза, биназа, мутант Glu43Ala/Phe81Ala, кристаллическая структура, нативная конформация, цитотоксичность

Благодарности. Авторы благодарят В.М. Митькевича за предоставление мутантной биназы.

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров, а также поддержана грантами РНФ 18-74-00108 в части характеристики структуры РНКаз и РФФИ 17-00-00060 (КОМФИ) в части определения цитотоксических свойств ферментов.

Литература

1. Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: Molecular weapons and their targets // FEBS Lett. – 2003. – V. 540, No 1–3 – P. 15–20. – doi: 10.1016/S0014-5793(03)00225-4.
2. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents // BioEssays. – 2008. – V. 30, No 8. – P. 781–790. – doi: 10.1002/bies.20789.
3. Ilinskaya O.N., Dreyer F., Mitkevich V.A., Shaw K.L., Pace C.N., Makarov A.A. Changing the net charge from negative to positive makes ribonuclease Sa cytotoxic // Protein Sci. – 2002. – V. 11, No 10. – P. 2522–2525. – doi: 10.1110/ps.0216702.
4. Ilinskaya O.N., Singh I., Dudkina E., Ulyanova V., Kayumov A., Barreto G. Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase) // Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Res. – 2016. – V. 1863, No 7. – P. 1559–1567. – doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.04.005.
5. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Kretova O.V., Zelenikhin P.V., Prassolov V.S., Tchurikov N.A., Ilinskaya O.N., Makarov A.A. Oncogenic c-kit transcript is a target for binase // Cell Cycle. – 2010. – V. 9, No 13. – P. 2674–2678. – doi: 10.4161/cc.9.13.12150.
6. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Spirin P.V., Fedorova T.V., Kretova O.V., Tchurikov N.A., Prassolov V.S., Ilinskaya O.N., Makarov A.A. Sensitivity of acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells to binase toxic action depends on the expression of KIT and АML1-ETO oncogenes //Cell Cycle. – 2011. – V. 10, No 23. – P. 4090–4097. – doi: 10.4161/cc.10.23.18210.
7. Ilinskaya O., Decker K., Koschinski A., Dreyer F., Repp H. Bacillus intermedius ribonuclease as inhibitor of cell proliferation and membrane current // Toxicology. – 2001. – V. 156, No 2–3. – P. 101–107. – doi: 10.1016/S0300-483X(00)00335-8.
8. Ilinskaya O.N., Koschinski A., Repp H., Mitkevich V., Dreyer F., Scholtz J.M., Pace C.N., Makarov A. RNase induced apoptosis: fate of calcium-activated potassium channels // Biochemie. – 2008. – V. 90, No 5. – P. 717–725. – doi: 10.1016/j.biochi.2008.01.010.
9. Mitkevich V.A., Tchurikov N.A., Zelenikhin P.V., Petrushanko I.Yu., Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Binase cleaves cellular noncoding RNAs and affects coding mRNAs // FEBS J. – 2010. – V. 277, No 1. – P. 186–196. – doi: 10.1111/j.1742-4658.2009.07471.x.
10. Mitkevich V.A., Schulga A.A., Trofimov A.A., Dorovatovskii P.V., Goncharuk D.A., Tkach E.N., Makarov A.A., Polyakov K.M. Structure and functional studies of the ribonuclease binase Glu43Ala/Phe81Ala mutant // Acta Cryst. Sect. D: Biol. Crystallogr. – 2013. – V. 69, No 6. – Р. 991–996. – doi: 10.1107/S0907444913004046.
11. Dudkina E., Kayumov A., Ulyanova V., Ilinskaya O. New insight into secreted ribonuclease structure: Binase is a natural dimer // PLoS One. – 2014. – V. 9, No 12. – Art. e115818, P. 1–14. – doi: 10.1371/journal.pone.0115818.
12. Dudkina E., Ulyanova V., Shah Mahmud R., Khodzhaeva V., Dao L., Vershinina V., Kolpakov A., Ilinskaya O. Three-step procedure for preparation of pure Bacillus altitudinis ribonucleas // FEBS Open Bio. – 2016. – V. 6, No 1. – Р. 24–32. – doi: 10.1002/2211-5463.12023.
13. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – V. 227, No 5259. – P. 680–685.
14. Polyakov K.M., Goncharuk, D.A., Trofimov, A.A., Safonova, T.N., Mitkevich V.A., Tkach E.N., Makarov A.A., Shulga A.A. X-ray diffraction and biochemical studies of W34F mutant ribonuclease binase // Mol. Biol. – 2010. – V. 44, No 5. – Р. 817–822. – doi: 10.1134/S0026893310050195.
15. Adjei A.A. Ras signaling pathway proteins as therapeutic targets // Curr. Pharm. Des. – 2001. – V. 7, No 16. – P. 1581–1594. – doi: 10.2174/1381612013397258.
16. Bos J.L. ras Oncogenes in human cancer: A review // Cancer Res. – 1989. – V. 49, No 17. – P. 4682–4689.

Поступила в редакцию

26.06.18

Дудкина Елена Владимировна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник OpenLab «Маркеры патогенеза» кафедры микробиологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: lenatimonina@rambler.ru

Ульянова Вера Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник OpenLab «Маркеры патогенеза» кафедры микробиологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: ulyanova.vera@gmail.com

Сурченко Юлия Владимировна, аспирант кафедры микробиологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: sokurenko.yulia@gmail.com

Нгуен Тхи Нга, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Ханойский медицинский университет

1-я ул. Тон Зат Тунг, округ Донг Да, г. Ханой, 116001, Вьетнам

E-mail: nn7189@gmail.com

Колпаков Алексей Иванович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник OpenLab «Маркеры патогенеза» кафедры микробиологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: ljoscha@mail.ru

Ильинская Ольга Николаевна, доктор биологических наук, заведующий кафедрой микробиологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E-mail: Ilinskaya_kfu@mail.ru

Для цитирования: Дудкина Е.В., Ульянова В.В., Сурченко Ю.В., Нгуен Н.Т., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Кристаллическая структура биназы не отражает ее нативную конформацию // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. – 2018. – Т. 160, кн. 4. – С. 591–600.

For citation: Dudkina E.V., Ulyanova V.V., Surchenko Yu.V., Nguen N.T., Kolpakov A.I., Ilinskaya O.N. Crystal structure of binase does not reflect its native conformation. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2018, vol. 160, no. 4, pp. 591–600. (In Russian)

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.