Н.В. Феоктистова, А.М. Марданова, М.Т. Лутфуллин, Л.М. Богомольная, М.Р. Шарипова
Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия
Техасский университет A&M, г. Брайан, 77807, США
Полный текст PDF
Аннотация
Работа посвящена описанию разработок биопрепаратов микробного происхождения – кормовых ферментов и ферментно-пробиотических комплексов для решения актуальных проблем промышленного птицеводства. Дана характеристика некрахмалистых полисахаридов (НПС) зерновых кормов, рассмотрены механизмы антипитательного действия НПС, препятствующие усвоению питательных веществ и энергии зерновых кормов, показано негативное влияние НПС на кишечную микробиоту. Рассмотрены механизмы позитивного действия экзогенных НПС-ферментов микробного происхождения на усвояемость кормов и микробиоту кишечника, показана целесообразность комплексных композиций, включающих НПС-ферменты, амилазы и протеазы. Описаны антипитательные свойства фитатов, содержащихся в кормах птицы, показана целесообразность применения фитаз микробного происхождения в качестве кормовых ферментов для птицеводства. Проанализирована перспективность ферментно-пробиотических комплексов в качестве альтернативы применения антибиотиков.
Ключевые слова: птицеводство, некрахмалистые полисахариды, фитаты, НПС-ферменты, протеазы, фитазы, пробиотики, микробиота
Литература
- FAO (Food and Agriculture Organization). 2014. FAOSTAT online database. – URL: http://faostat.fao.org/.
- Godfray H.C.J., Beddington J.R., Crute I.R., Haddad L., Lawrence D., Muir J.F., Pretty J., Robinson S., Thomas S.M., Toulmin C. Food security: The challenge of feeding 9 billion people // Science. – 2010. – V. 327. –P. 812–818. – doi: 10.1126/science.1185383.
- Kiarie E., Romero L.F., Nyachoti C.M. The role of added feed enzymes in promoting gut health in swine and poultry // Nutr. Res. Rev. – 2013. – V. 26, No 1. – P. 71–88. – doi: 10.1017/S0954422413000048.
- Park Y.H., Hamidon F., Rajangan Ch., Soh K.P., Gan Ch.Yu., Lim Th.S., Abdullah W.N.W., Liong M.T. Application of probiotics for the production of safe and high-quality poultry meat // Korean J. Food Sci. Anim. Resour. – 2016. – V. 36, No 5. – Р. 567–576. – doi: 10.5851/kosfa.2016.36.5.567.
- Gadde U., Kim W.H., Oh S.T., Lillehoj H.S. Alternatives to antibiotics for maximizing growth performance and feed efficiency in poultry: A review // Anim. Health Res. Rev. – 2017. – V. 18, No 1. – P. 26–45. – doi: 10.1017/S1466252316000207.
- Knudsen K.E. Fiber and nonstarch polysaccharide content and variation in common crops used in broiler diets // Poult. Sci. – 2014. – V. 93, No 9. – P. 2380–2393. – doi: 10.3382/ps.2014-03902.
- Kebreab E., Liedke A., Caro D., Deimling S., Binder M., Finkbeiner M. Environmental impact of using specialty feed ingredients in swine and poultry production: A life cycle assessment // J. Anim. Sci. – 2016. – V. 94, No 6. – P. 2664–2681. – doi: 10.2527/jas.2015-9036.
- Фисинин В.И., Егоров И.А. Современные подходы к кормлению высокопродуктивной птицы // Птица и птицепродукты. – 2015. – № 3. – С. 27–29.
- Romero L.F., Sands J.S., Indrakumar S.E., Plumstead P.W., Dalsgaard S., Ravindran V. Contribution of protein, starch, and fat to the apparent ileal digestible energy of corn- and wheat-based broiler diets in response to exogenous xylanase and amylase without or with protease // Poult. Sci. – 2014. – V. 93, No 10. – P. 2501–2513. – doi: 10.3382/ps.2013-03789.
- Фисинин В.И., Егоров И.А., Ленкова Т.Н. Использование нетрадиционных кормов в рационе птицы // Птица и птицепродукты. – 2016. – № 4. – С. 14–17.
- Ravindran V., Son J.-H. Feed enzyme technology: Present status and future developments // Recent Pat. Food Nutr. Agric. –2011. – V. 3, No 2. – P. 102–109.
- Adeola O., Cowieson A.J. Board-invited review: Оpportunities and challenges in using exogenous enzymes to improve non-ruminant animal production // J. Anim. Sci. – 2011. – V. 89, No 10. – P. 3189–3218. – doi: 10.2527/jas.2010-3715.
- Dersjant-Li Y., Awati A., Schulze H., Partridge G. Phytase in non-ruminant animal nutrition: A critical review on phytase activities in the gastrointestinal tract and influencing factors // J. Sci. Food Agric. – 2015. – V. 95, No 5. – Р. 878–896. – doi: 10.1002/jsfa.6998.
- Diaz D. M., Morlacchini F., Masoero M., Moschini G., Fusconi G. Pea seeds (Pisum sativum), faba beans (Vicia faba var. minor) and lupin seeds (Lupinus albus var. multitalia) as protein sources in broiler diets: effect of extrusion on growth performance // Ital. J. Anim. Sci. – 2006. – V. 5. – P. 43–53.
- Кундышев П., Ландшафт М., Кузнецов А. Способы повышения эффективности птицеводства // Птицеводство. – 2013. – T. 6. – C. 19–22.
- Shewry P.R., Hawkesford M.J., Piironen V., Lampi A.M., Gebruers K., Boros D., Andersson A.A., Aman P., Rakszegi M., Bedo Z., Ward J.L. Natural variation in grain composition of wheat and related cereals // J. Agric. Food Chem. – 2013. – V. 61, No 35. – P. 8295–8303. – doi: 10.1021/jf3054092.
- Dornez E., Gebruers K.I., Joye J.B., Ketelaere De.J., Lenartz C., Massau B., Bodson J., Delcour A.C., Courtin M. Effects of genotype, harvest year and genotype-by-harvest year interactions on arabinoxylan, endoxylanase activity and endoxylanase inhibitor levels in wheat kernels // J. Cereal Sci. – 2008. – V. 47, No 2. – P. 180–189. – doi: 10.1016/j.jcs.2007.03.008.
- Каблучеева-Пашник Т.И., Кощаев А.Г. Фармакологическое обоснование применения пробиотиков в птицеводстве. – Краснодар: Изд-во КубГАУ, 2016. – 270 с.
- O'Neill H.V.M., Smith J.A., Bedford M.R. Multicarbohydrase enzymes for non-ruminants // Asian-Australas. J. Anim. Sci. – 2014. – V. 27, No 2. – P. 290–301. – doi: 10.5713/ajas.2013.13261.
- Khadem A., Lourenzo M., Delezie E., Maertens L., Goderis A., Mombaerts R., Höfte M., Eeckhaut V., Van Immerseel F., Janssens G.P. Does release of encapsulated nutrients have an important role in the efficacy of xylanase in broilers? // Poult. Sci. – 2016. – V. 95, No 5. – P. 1066–1076. – doi: 10.3382/ps/pew002.
- Timbermont L., Haesebrouck F., Ducatelle R., Van Immerseel F. Necrotic enteritis in broilers: An updated review on the pathogenesis // Avian Pathol. – 2011. – V. 40, No 4. – P. 341–347. – doi: 10.1080/03079457.2011.590967.
- Bielke L.R., Hargis B.M., Latorre J.D. Impact of enteric health and mucosal permeability on skeletal health and lameness in poultry // Adv. Exp. Med. Biol. – 2017. – V. 1033. – P. 185–197. – doi: 10.1007/978-3-319-66653-2_9.
- Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I.S. Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2002. – V. 66, No 3. – P. 506–577.
- Sharma A., Tewari R., Rana S.S., Soni R., Soni S.K. Cellulases: Classification, methods of determination and industrial applications // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2016. – V. 179, No 8. – P. 1346–1380. – doi: 10.1007/s12010-016-2070-3.
- Kölln M., Weiβ H., Hankel J., Kamphues J. Effects of a carbohydrase complex added in different inclusion rates in feeds for broilers on growth performance, digesta viscosity and foot pad health // J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berlin). – 2017. – V. 101, Suppl. 1. – P. 105–109. – doi: 10.1111/jpn.12701.
- Yuan L., Wang M., Zhang X., Wang Z. Effects of protease and non-starch polysaccharide enzyme on performance, digestive function, activity and gene expression of endogenous enzyme of broilers // PloS One. – 2017. – V. 12, No 3. – Art. e0173941, P. 1–13. – doi: 10.1371/journal.pone.0173941.
- Latorre J.D., Hernandes-Velasco X., Kutappan V.A., Wolfenden R.E., Vicente J.L., Wolfenden A.D., Bielke L.R., Prado-Rebolledo O.F., Morales E., Hargis B.M., Tellez G. Selection of Bacillus spp. for cellulase and xylanase production as direct-fed microbials to reduce digesta viscosity and Clostridium perfringens proliferation using an in vitro digestive model in different poultry diets // Front Vet. Sci. – 2015. – V. 2. – Art. 25, P. 1–8. – doi: 10.3389/fvets.2015.00025.
- Bedford M.R., Cowieson A.J. Exogenous enzymes and their effects on intestinal microbiology // Anim. Feed Sci. Technol. – 2012. – V. 173, No 1–2. – P. 76–85. – doi: 10.1016/j.anifeedsci.2011.12.018.
- Amerah A.M., Mathis G., Hofacre C.L. Effect of xylanase and a blend of essential oils on performance and Salmonella colonization of broiler chickens challenged with Salmonella Heidelberg // Poult. Sci. – 2012. – V. 91, No 4. – P. 943–947. – doi: 10.3382/ps.2011-01922.
- Шастак Е.В. Активность НПС-ферментов in vitro не гарантирует их эффективность in vivo // Птицеводство. – 2016. – № 10. – С. 10–14.
- Крюков В.С. Оценка качества кормовых ферментных препаратов // Птицеводство. – 2016. – № 10. – C. 2–7.
- Contesini F.J., Melo R.R., Sato H.H. An overview of Bacillus proteases: From production to application // Crit. Rev. Biotechnol. – 2018. – V. 38, No 3. – P. 321–334. – doi: 10.1080/07388551.2017.1354354.
- Kaczmarek S.A., Rogiewicz A., Mogielnicka M., Rutkowski A., Jones R.O., Slominski B.A. The effect of protease, amylase, and nonstarch polysaccharide-degrading enzyme supplementation on nutrient utilization and growth performance of broiler chickens fed corn-soybean meal-based diets // Poult. Sci. – 2014. – V. 93, No 7. – P. 1745–1753. – doi: 10.3382/ps.2013-03739.
- Yuan L., Wang S.Q., Wang Z.X., Zhu H., Huang K. Effects of exogenous protease supplementation on endogenous trypsin activity and gene expression in broilers // Genet. Mol. Res. – 2015. – V. 14, No 4. – P. 13633–13641. – doi: 10.4238/2015.October.28.25.
- Svihus B., Uhlen A.K., Harstad O.M. Effect of starch granule structure, associated components and processing on nutritive value of cereal starch: A review // Anim. Feed Sci. Technol. – 2005. – V. 122, No 3–4. – P. 303–320. – doi: 10.1016/j.anifeedsci.2005.02.025.
- Olukosi O.A., Beeson L.A., Englist K., Romero L.F. Effects of exogenous proteases without or with carbohydrases on nutrient digestibility and disappearance of non-starch polysaccharides in broiler chickens // Poult. Sci. – 2015. – V. 94, No 11. – P. 2662–2699. – doi: 10.3382/ps/pev260.
- Amerah A.M., Romero L.F., Awati A., Ravindran V. Effect of exogenous xylanase, amylase, and protease as single or combined activities on nutrient digestibility and growth performance of broilers fed corn/soy diets // Poult. Sci. – 2017. – V. 96, No 4. – P. 807–816. – doi: 10.3382/ps/pew297.
- Ленкова Т.Н., Егорова Т.А., Яцышина М.М., Сысоева И.Г., Зевакова В.К. Зернобобовые культуры в комбикормах для бройлеров // Птица и птицепродукты. – 2016. № 4. – С.17–19.
- Iqbal Z., Roberts J., Perez-Maldonado R.A, Goodarzi Boroojeni F., Swick R.A., Ruhnke I. Pasture, multi-enzymes, benzoic acid and essential oils positively influence performance, intestinal organ weight and egg quality in free-range laying hens // Br. Poult. Sci. – 2018. – V. 59, No 2. – P. 180–189. – doi: 10.1080/00071668.2017.1403566.
- Romero L.F., Parsons C.M., Utterback P.L., Plumstead P.W., Ravindran V. Comparative effects of dietary carbohydrases without or with protease on the ileal digestibility of energy and amino acids and AMEn in young broilers // Anim. Feed Sci. Technol. – 2013. – V. 181, No 1–4. – P. 35–44. – doi: 10.1016/j.anifeedsci.2013.02.001.
- Woyengo T.A., Nyachoti C.M. Review: Anti-nutritional effects of phytic acid in diets for pigs and poultry – current knowledge and directions for future research // Can. J. Anim. Sci. – 2013. – V. 93, No 1. – P. 9–21. – doi: 10.4141/cjas2012-017.
- Балабан Н.П., Сулейманова А.Д., Валеева Л.Р., Шакиров Е.В., Шарипова М.Р. Структурные особенности и механизм катализа β-пропеллерных фитаз бацилл (обзор) // Биохимия. – 2016. – Т. 81, Вып. 8. – С. 1013–1022.
- Bohn L., Meyer A.S., Rasmussen S.K. Phytate: Impact on environment and human nutrition. A challenge for molecular breeding // J. Zhejiang Univ. Sci. B. – 2008. – V. 9, No 3. – P. 165–191. – doi: 10.1631/jzus.B0710640.
- Мухаметзянова А.Д., Ахметова А.И., Шарипова М.Р. Микроорганизмы как продуценты фитаз // Микробиология. – 2012. – Т. 81, Вып. 3. – С. 291–300.
- Marounek M., Skřivan M., Rosero O., Rop O. Intestinal and total tract phytate digestibility and phytase activity in the digestive tract of hens fed a wheat-maize-soyabean diet // J. Anim. Feed Sci. – 2010. – V. 19, No 3. – P. 430–439. – doi: 10.22358/jafs/66305/2010.
- Kebreab E., Hansen V., Strathe A.B. Animal production for efficient phosphate utilization: From optimized feed to high efficiency livestock // Curr. Opin. Biotechnol. – 2012. – V. 23, No 6. – P. 872–877. – doi: 10.1016/j.copbio.2012.06.001.
- Lei X.G., Weaver J.D., Mullaney E., Ullah A.H., Azain M.J. Phytase, a new life for an “old” enzyme // Annu. Rev. Anim. Biosci. – 2013. – V. 1. – P. 283–309. – doi: 10.1146/annurev-animal-031412-103717.
- Синицына О.Л., Федорова Е.A., Гусаков А.В., Упоров И.В., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Чулкин A.M., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства внеклеточной фитазы A Рenicillium canescens // Биохимия. – 2006. – Т. 71, Вып. 9. – С. 1260–1269.
- Пат. 2504579 C2 РФ. Рекомбинантный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцент фитазы / Выборная Т.В., Юзбашев Т.В., Федоров А.С., Юзбашева Е.Ю., Ларина А.С., Синеокий С.П. – № 2012114468/10; заявл. 12.04.2012; опубл. 20.01.2014, Бюл. № 2. – 7 с.
- Пат. 2472855 С2 РФ. Мутантная рекомбинантная термостабильная фитаза (варианты), фрагмент днк, кодирующий указанную фитазу (варианты), штамм Pichia pastoris – продуцент указанной фитазы (варианты) / Гордеева Т.Л., Борщевская Л.Н., Синеокий С.П. – № 2009146172/10; заявл. 15.12.2009; опубл. 20.01.2013, Бюл. № 2. – 37 с.
- Пат. 2506307 С2 РФ. Штамм бактерий Bacillus subtilis с высоким уровнем продуцирования фитазы (варианты), композиция для кормления животных и способ кормления животных / Кнап И., Кнарреборг А., Лесер Т.Д., Лунн Б.– № 2010104004/10; заявл. 11.06.2008; опубл. 10.02.2014, Бюл. № 4. – 22 с.
- Ахметова А.И., Нямсурэн Ч., Балабан Н.П., Шарипова М.Р. Выделение и характеристика новой фитазы бацилл // Биоорган. химия. – 2013. – Т. 39, Вып. 4. – C. 430–436.
- Woyengo T.A., Nyachoti C.M. Review: Supplementation of phytase and carbohydrases to diets for poultry // Can. J. Anim. Sci. – 2011. – V. 91, No 2. – P. 177–192. – doi: 10.4141/cjas10081.
- Amerah A.M., Plumstead P.W., Barnard L.P., Kumar A. Effect of calcium level and phytase addition on ileal phytate degradation and amino acid digestibility of broilers fed corn-based diets // Poult. Sci. – 2014. – V. 93, No 4. – P. 906–915. – doi: 10.3382/ps.2013-03465.
- Yu S., Cowieson A., Gilbert C., Plumstead P., Dalsgaard S. Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1–5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin // J. Anim. Sci. – 2012. – V. 90, No 6. – P. 1824–1832. – doi: 10.2527/jas.2011-3866.
- Cowieson A.J., Ravindran V. Sensitivity of broiler starters to three doses of an enzyme cocktail in maize-based diets // Br. Poult. Sci. – 2008. – V. 49, No 3. – P. 340–346. – doi: 10.1080/00071660802126669.
- Wu D., Wu S.B., Choct M., Swick R.A. Performance, intestinal microflora, and amino acid digestibility altered by exogenous enzymes in broilers fed wheat- or sorghum-based diets // J. Anim. Sci. – 2017. – V. 95, No 2. – P. 740–751. – doi: 10.2527/jas.2016.0411.
- Ptak A., Bedford M.R., Świątkiewicz S., Žyła K., Józefiak D. Phytase modulates ileal microbiota and enhances growth performance of the broiler chickens // PLoS One. – 2015. – V. 10, No 3. – Art. e0119770, Р. 1–15. – doi: 10.1371/journal.pone.0119770.
- Borda-Molina D., Vital M., Sommerfeld V., Rodehutscord M., Camarinha-Silva A. Insights into broilers' gut microbiota fed with phosphorus, calcium, and phytase supplemented diets // Front. Microbiol. – 2016. – V. 7. – Art. 2033, P. 1–13. – doi: 10.3389/fmicb.2016.02033.
- Gao C., Ma Q., Zhao L., Zhang J., Ji C. Effect of dietary phytase transgenic corn on physiological characteristics and the fate of recombinant plant DNA in laying hens // Asian-Australas. J. Anim. Sci. – 2014. – V. 27, No. 1. – P. 77–82. – doi: 10.5713/ajas.2013.13265.
- Conley D.J., Paerl H.W., Howarth R.W. Controlling eutrophication: Nitrogen and phosphorus // Science. – 2009. – V. 323. – P. 1014–1015. – doi: 10.1126/science.1167755.
- Tubiello F.N., Salvatore M., Rossi S., Ferrara A., Fitton N., Smith P. The FAOSTAT database of greenhouse gas emissions from agriculture // Environ. Res. Lett. – 2013. – V. 8, No 1. – Art. 015009, P. 1–10. – doi: 10.1088/1748-9326/8/1/015009.
- Cиницына О.А., Федорова Е.А., Гусаков А.В. Упоpов И.В., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Ушакова Н.А., Некрасов Р.В., Правдин В.Г., Кравцова Л.З., Бобровская О.И., Павлов Д.С. Новое поколение пробиотических препаратов кормового назначения // Фундаментальные исследования. – 2012. – №. 1. – C. 184–192.
- Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность // Химическая и биологическая безопасность. – 2007. – №. 2–3. – C. 20–41.
- Феоктистова Н.В., Марданова А.М., Хадиева Г.Ф., Шарипова М.Р. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus в птицеводстве // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. – 2017. – T. 159, кн. 1. – С. 85–107.
- Топурия Л.Ю., Топурия Г.М., Григорьева Г.В. Фармакологические аспекты применения пробиотиков в бройлерном птицеводстве. – Оренбург: Изд. центр ВНИИМС, 2012. – 95 с.
- Askelson T.E., Flores C.A, Dunn-Horrocks S.L, Dersjant-Li Y., Gibbs K., Awati A., Lee J.T, Duong T. Effects of direct-fed microorganisms and enzyme blend co-administration on intestinal bacteria in broilers fed diets with or without antibiotics // Poult. Sci. – 2018. – V. 97, No 1. – P. 54–63. – doi: 10.3382/ps/pex270.
- Latorre J.D., Hernandez-Velasco X., Wolfenden R.E., Vicente J.L., Wolfenden A.D., Menconi A., Bielke L.R., Hargis B.M., Tellez G. Evaluation and selection of Bacillus species based on enzyme production, antimicrobial activity, and biofilm synthesis as direct-fed microbial candidates for poultry // Front. Vet. Sci. – 2016. – V. 3. – Art. 95, P. 1–9. – doi: 10.3389/fvets.2016.00095.
- Кощаев А.Г. Эффективность кормовых добавок Бацелл и Моноспорин при выращивании цыплят-бройлеров // Ветеринария. – 2007. – № 1. – C. 16–17.
- Пат.2235772 С1 РФ. Штамм бактерий Bacillus pantothenticus 1-85 для использования в гранулированных кормах / Грудинина Т.Н., Лаптев Г.Ю., Прокопьева В.И., Солдатова В.В., Проворов Е.Л. – № 2003103720/13; заявл. 29.01.2003; опубл. 10.09.2004, Бюл. № 25. – 3 с.
- Farhat-Khemakhem A., Blibech M., Boukhris I., Makni M., Chouayekh H. Assessment of the potential of the multi-enzyme producer Bacillus amyloliquefaciens US573 as alternative feed additive // J. Sci. Food. Agric. – 2018. – V. 98, No 3. – P. 1208–1215. – doi: 10.1002/jsfa.8574.
Поступила в редакцию
04.06.18
Феоктистова Наталия Владимировна, научный сотрудник лаборатории «Микробные биотехнологии»
Казанский (Приволжский) федеральный университет
ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия
E-mail: nfeoktis@mail.ru
Марданова Айслу Миркасымовна, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии
Казанский (Приволжский) федеральный университет
ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия
E-mail: mardanovaayslu@mail.ru
Лутфуллин Марат Тафкилевич, инженер кафедры микробиологии
Казанский (Приволжский) федеральный университет
ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия
E-mail: : lutfullin.marat2012@yandex.ru
Богомольная Лидия Михайловна, кандидат биологических наук, профессор Центра здоровья
Техасский университет A&M
Риверсайд Парквей 8447, г. Брайан, 420008, США
E-mail: Bogomolnaya@medicine.tamhsc.edu
Шарипова Маргарита Рашидовна, доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии
Казанский (Приволжский) федеральный университет
ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия
E-mail: marsharipova@gmail.com
Для цитирования: Феоктистова Н.В., Марданова А.М., Лутфуллин М.Т., Богомольная Л.М., Шарипова М.Р. Биопрепараты микробного происхождения в птицеводстве // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. – 2018. – Т. 160, кн. 3. – С. 395–418.
For citation: Feoktistova N.V., Mardanova A.M., Lutfullin M.T., Bogomolnaya L.M., Sharipova M.R. Microbial preparations in poultry farming. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2018, vol. 160, no. 3, pp. 395–418. (In Russian)
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.