Лаборатория пробоподготовки для санирующей электронной микроскопии
Лаборатория пробоподготовки для сканирующей электронной микроскопии оснащена рядом установок различного профиля, основной целью которых является приготовление проб к исследованию в сканирующем электронном микроскопе.
Оборудование представлено тремя группами приборов.
Вакуумное напыление
Вакуумные напылительные установки фирмы Quorum предназначены для нанесения методом катодного и термического напыления сверхтонких покрытий углерода, хрома, золота и золота/палладия на образцы в условиях среднего и высокого вакуума для получения проводящей поверхности. Напыление золотом/палладием необходимо для получения изображений сверхвысокого разрешения и работы детекторов автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа. Также в вакуумных установках Quorum проводится ионное утонение и ионная очистка поверхностей, это позволяет получать изображения наноморфологии поверхностей без учета искусственных неровностей. Все установки имеют встроенное программное управление.
Вакуумные посты Quorum Q150 ES и Quorum Q150T ES
Сушка в критической точке
Сушка в критической точке Quorum K850 предназначена для обезвоживания препаратов влажных объектов, в основном биологических. Работа установки позволяет избежать деформаций и разрушения хрупких образцов в процессе высушивания в условиях высокого вакуума и готовит их к напылению проводящего слоя. В процессе сушки происходит вытеснение воды и водяных паров жидкой углекислотой в критической точке с последующим вытеснением и высушиванием углекислым газом. После процедуры сушки объект переносится в вакуумную установку для напыления.
Сушка в критической точке Quorum K850
Материаловедческая пробподготовка.
Материаловедческая пробоподготовка включает в себя группу приборов, осуществляющих цикл операций по подготовке препаратов к сканирующей электронной микроскопии. Лаборатория включает в себя линейный прецизионный отрезной станок, автоматический станок для горячей запрессовки, систему вакуумной пропитки, шлифовально-полировальный станок, вибрационный полировальный станок. В результате полного цикла подготовки, как сам образец, так и его поверхность подготавливается к исследованию в сканирующем электронном микроскопе и получению изображений с максимальным разрешением.
Линейный отрезной станок Buehler IsoMet 5000 позволяет приготовить прецизионные срезы негабаритных образцов для дальнейшей подготовки к сканированию.
Линейный прецизионный отрезной станок Buehler IsoMet 5000
Автоматический станок для горячей запрессовки предназначен для иммобилизации образца в специальный компаунд. Он готовит образец к дальнейшей обработке и подготовке поверхности. В зависимости от задач компаунд может быть проводящим и непроводящим. Прибор работает в температурном диапазоне 50-300 0С и при давлении 80-300 бар. Плавный нагрев и охлаждение позволяют избежать деформации образца.
Автоматический станок для горячей запрессовки образцов Buehler SimpliMet
Установка вакуумной полимеризации Buehler Cast N Vac 1000 предназначена для иммобилизации мелких, хрупких и сыпучих объектов в специальные смолы. Фиксация объектов в смоляных блоках позволяет провести дальнейшую обработку их поверхности для исследования в сканирующем электронном микроскопе.
Установка вакуумной полимеризации Buehler Cast N Vac 1000
Шлифовально-полировальный станок EcoMet предназначен для полировки поверхности образца, заключенного в компаунде. При помощи использования различных шлифовальных и полировальных дисков шероховатость поверхности после обработки может достигать 1 мкм. Широкие возможности управления параметрами работы прибора позволяют подобрать индивидуальные условия для каждого объекта.
Шлифовально-полировальный станок EcoMet 250 с полуавтоматической насадкой AutoMet 250
Вибрационная установка VibroMet 2 предназначена для получения итоговой поверхности с минимальными значениями шероховатости. Использование специальных полировальных паст и прецизионная работа прибора позволяют достигнуть шероховатости поверхности до 50 нм. Также возможна тонкая регулировка для создания наиболее щадящего режима
Вибрационная установка VibroMet 2
ЛАБОРАТОРИЯ ПРОБОПОДГОТОВКИ К ПРОСВЕЧИВАЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Лаборатория предназначена для комплексной подготовки биологических образцов к исследованию в просвечивающем электронном микроскопе, а также в специализированной приставке для работы в режиме просвета на сканирующем электронном микроскопе. В лаборатории осуществляется химическая подготовка биологических и биомедицинских препаратов для дальнейшего приготовления ультратонких срезов и их исследования под электронным микроскопом. Базовая пробоподготовка включает в себя контрастирование образцов по классической схеме, визуализирующей основные органические макромолекулы. Реактивы и материалы, необходимые для специализированной дифференциальной окраски предоставляются заказчиком.
Оборудование представлено двумя группами приборов.
Химическая пробоподготовка, пропитка и заливка в смолы.
В электронном микроскопе исследуемый образец сталкивается с агрессивными условиями, такими как высокий вакуум и воздействие концентрированного пучка электронов. Эти условия накладывают определенные требования к образцу для сохранения его целостности и получения адекватных и воспроизводимых данных.
На первом этапе пробоподготовки производится химическая фиксация и многостадийное обезвоживание образцов. После полного обезвоживания образец постепенно пропитывается эпоксидными смолами, заполняющей все полости объекта, в которых ранее находилась вода. По завершении пропитки смола полимеризуется, заключая объект в полимерный блок.
Упрощенная схема первого этапа пробоподготовки:
Этап | Процедура | Затрачиваемое время | Промежуточный результат |
Химическая фиксация | Образцы помещаются в 1% глутаровый альдегид (glutar aldehide) на 12-18 часов, либо в 2,5% глутаровый альдегид на 4 часа. | 4-18 часов | Полная химическая фиксация всех биологических молекул, остановка «биохимической жизни» клеток |
Промывка | Освобождение от глутарового альдегида промыванием образцов в буферном растворе | 15-30 минут | Образец, прореагировавший с глутаровым альдегидом |
Постфиксация | Образцы помещаются в тетроксид осмия (osmium tetroxide) | 2 часа | Окисление всех непрореагировавших с глутаровым альдегидом активных групп, первичное контрастирование |
Промывка | Освобождение от тетроксида осмия | 15-30 минут | Образец, прореагировавший с тетроксидом осмия |
Обезвоживание | Постадийное помещение образца в растворы этилового спирта с повышающейся концентрацией от 30% до 100% (абсолютизированный спирт) | 4-6 часов | Вода в образце полностью замещена этиловым спиртом |
Обезвоживание | Помещение образца в 99,9% окись пропилена | 40-60 минут | Этиловый спирт в образце полностью замещен на окись пропилена |
Пропитка | Помещение образца в растворы эпоновых смол в окиси пропилена поэтапно с повышением соотношения смола:окись пропилена (1:2, 1:1, 2:1) с непрерывным перемешиванием. Помещением образцов в капсулы с чистой смолой | 3 суток | Образец пропитан смолой, окись пропилена постепенно вытеснена чистой смолой. |
Полимеризация | Капсулы с образцами в чистой смоле поэтапно полимеризуются в термостатах при постепенном повышении температуры от 37 до 60 градусов | 3 суток | Образец иммобилизованный в полимерном блоке готовый к ультратонкой резке. |
Ультратонкая резка
На втором этапе пробоподготовки полимерные блоки затачиваются и производится ультратонкая резка на ульрамикротоме Leica Ultracut UC7.
Ультрамикротом Leica Ultracut UC7
Полученные серийные срезы толщиной 60-80 нм фиксируются на 3 миллиметровых медных или никелевых сеточках, которые после процедур контрастирования исследуются в электронном микроскопе.
Проведение специализированной пробоподготовки позволяет наблюдать биологические объекты в просвечивающем электронном микроскопе на увеличениях от 1 000 до 1 000 000крат и разрешающей способностью 0.2 нм.