Ученые КФУ разработали способ диагностики микробиоты кишечника при терапии Helicobacter pylori

В Междисциплинарном центре протеомных исследований Института фундаментальной медицины и биологии КФУ

Исследователи Казанского федерального университета создают диагностическую панель для оценки состояния кишечной микрофлоры на фоне эрадикационной терапии инфекции Helicobacter pylori,  а также ассоциированных заболеваний (считается, что многие случаи язв желудка и двенадцатиперстной кишки, гастритов, дуоденитов, рака желудка и, возможно, некоторые случаи лимфом желудка этиологически связаны с инфекцией спиралевидной бактерии Helicobacter pylori, - прим.авт.).

Так, ученые проводят полногеномный анализ микробных сообществ и пытаются установить роли отдельных представителей в составе микробиоты кишечника, а также закономерности изменения сообществ в ответ на прием фармацевтических препаратов. В конечном итоге должна быть разработана диагностическая панель на основе ПЦР, позволяющая оценивать состояние кишечной микрофлоры. На сегодняшний день по данным полногеномного секвенирования (расшифровки генома) свыше  200 образцов содержимого кишечника удалось наметить около 300 маркеров, изменяющихся в ответ на антибиотикотерапию. Надо сказать, что исследовались только те микроорганизмы, которые определенно точно встречаются в кишечной микрофлоре всех исследуемых людей.

Благодаря проведенной исследовательской работе ученые надеются просчитать «слабый» и «сильный» типы кишечной микрофлоры человека, отследить, какие группы микроорганизмов исчезают, какие начинают доминировать в кишечной микрофлоре при антибиотикотерапии, насколько больше становится генов устойчивости к антибиотикам у микроорганизмов и при каких условиях, какие существуют для человека риски при приеме препаратов и пр.

Научный проект реализуется в лаборатории Омиксных технологий Междисциплинарного центра протеомных исследований Института фундаментальной медицины и биологии КФУ.

Поддержку проект получил в августе 2014 году в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы». В течение трех лет на его реализацию было выделено порядка 19 млн рублей.

«По условиям субсидии в рамках ФЦП мы должны собрать 250 образцов содержимого кишечника: 100 образцов от контрольной группы и 150 - от пациентов с инфекцией Helicobacter pylori и различными ассоциированными заболеваниями, - рассказывает старший научный сотрудник Института фундаментальной медицины и биологии КФУ Татьяна Григорьева. – Нужно отметить, что проект зонтичный. Поддержку в рамках ФЦП получило еще три проекта по схожей тематике – наши коллеги и партнеры из Томского медицинского университета и двух московских научно-исследовательских центров помогают нам со сбором материалов и обработкой данных. Тематика их проектов – исследование микробиоты, ее патологий при других заболеваниях – хронической обструктивной болезни легких, алкоголизме, болезни Крона».

Необходимо отметить, что проект, обязательства по которому ученые КФУ исполняют уже третий год, реализуется согласно графику, а что касается сбора образцов и их секвенирования, даже с опережением.

«Мы набрали уже свыше 200 образцов, - подчеркивает Т. Григорьева. - Подана заявка на патент - способ диагностики состояния микробиоты кишечника на фоне эрадикационной терапии Helicobacter pylori. Создана база данных генетических маркеров микроорганизмов кишечника. На основании полученных данных – нам удалось, во-первых, сделать вывод о том, что изначально люди, независимо от того, здоровы они или больны, имеют очень разную по своему составу микробиоту. Поэтому определить группы микроорганизмов, которые могли бы охарактеризовать состояние человеческой микрофлоры как нормальное или ненормальное, очень тяжело. Слишком много индивидуальных особенностей. И, конечно, 200 образцов – очень мало для того, чтобы провести группировку и здоровых, и болеющих людей».

Но, по словам ученого, общие тенденции, закономерности все же есть. Изменения происходят на фоне применения антибиотиков – в этом случае некоторые группы микроорганизмов из кишечника человека попросту исчезают.

Количественное распределение видов в составе микробного сообщества кишечного содержимого в опытных образцах до и после проведения антибиотикотерапии

Сложность в том, что есть люди, у которых изначально отсутствуют бифидобактерии, или изначально снижена доля лактобактерий в кишечной микрофлоре. Поэтому и важна как можно более расширенная выборка образцов. В результате было принято решение анализировать образцы, полученные в рамках реализации всех четырех зонтичных проектов. Так, в сотрудничестве с коллегами из Москвы и Томска в группе контроля имеется уже не 100, а все 400 человек.

Состояние микробных сообществ кишечника ученые оценивали с помощью методов, пришедших в биомедицину из экологии. Это, прежде всего, индекс Шеннона, так называемый индекс разнообразия, а также специфические, биоинформатические методы работы с метагеномными данными - метрика Брей Кёртиса, в которой оценивается таксономическое расстояние между одним и другим состоянием сообщества после применения антибиотиков. По этим дистанциям, тому, насколько сообщество изменилось в сравнении со своим первоначальным состоянием, исследователям КФУ удалось ранжировать пациентов с сильными, средними, слабыми побочными эффектами фармакотерапии на кишечную микрофлору.

«Надо отметить, что у 80 процентов пациентов были либо слабые, либо средние, умеренные эффекты после приема антибиотиков, - отмечает Татьяна Григорьева. - Только лишь около 20 процентов пациентов имели сильные изменения в структуре сообщества. Мы пока не знаем, как к этому относиться.  Нужно иметь в виду, что изначально некоторые пациенты уже имели нарушенную кишечную микрофлору. К примеру, у них доминировал один и не самый полезный вид в составе сообщества, а само сообщество было узкое, не развитое. В этом случае прием антибиотиков мог повлиять положительно, погасив не только Helicobacter pylori, но и другие сопутствующие патогенные или нетипичные для кишечной микрофлоры микроорганизмы. Очень радует, что есть люди, у которых микрофлора не сильно страдала от жесткого, двухнедельного приема антибиотиков. Это заслуживает пристального внимания – мы надеемся просчитать «слабый» и «сильный» энтеротип, когда прием антибиотиков может быть противопоказан, вернее, когда сначала необходимо пройти курс восстановления кишечника, а уже потом пить антибиотики. Также нас интересуют устойчивые сообщества, когда микробиота не будет подвергаться сильным изменениям в ответ на фармацевтические средства».

В настоящее время исследователи уже опубликовали свои результаты в научных журналах «Гены и клетки», «Антибиотики и Химиотерапия», также подана заявка на публикацию в Journal of Bionanoscience. Доклады на тему исследований представлены на международных гастроэнтерологических конгрессах в Латвии и в Вене. Кроме того, от журнала «Gastroenterology» ученым поступило предложение на публикацию полнотекстового доклада. Ученые КФУ являются соавторами и ряда публикаций томских и московских коллег.

Как уже было сказано, конечная цель исследователей – создание для клинических условий диагностической панели для оценки состояния кишечной микрофлоры на фоне лечения Helicobacter pylori.

Именно для этого ученые расшифровывают геном всех микроорганизмов, обитающих в кишечнике человека.

«С помощью этого мы можем определить не только состав сообщества, то есть, какие  виды в нем присутствуют, но еще и функциональную нагрузку, то есть, их биохимические свойства, - говорит Т. Григорьева. - Акцент делается на совокупности генов, определяющих устойчивость микроорганизмов к антибиотикам. Соответственно, на основе данных массового секвенирования мы можем отследить не только изменение таксономического состава - какие группы микроорганизмов исчезают, какие начинают доминировать в сообществе, но еще и посмотреть как меняются метаболические функции микробиоты, насколько больше становится генов антибиотикорезистентности, какие существуют риски, связанные с приемом препаратов».